Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒實驗原理

Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒說明書

Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒AlamaBlue 細胞活力檢測試劑盒提供了一種可靠、靈敏、安全和低成本的快速有效檢測細胞活力與毒性的方法。AlamaBlue 通過在細胞生長的培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的化學(xué)還原反應(yīng)，將非熒光信號的染料轉(zhuǎn)換成為一紅色熒光物質(zhì)，試鹵靈（9-羥基-3-異吩惡嗪酮7-羥基-3H-吩惡嗪-3-酮），從而檢測細胞的存活率。維持細胞需要還原性環(huán)境而抑制生長則表現(xiàn)為氧化型環(huán)境。細胞生長率相關(guān)的降低可表現(xiàn)為氧化還原指示劑從氧化型（非熒光素、紫色）轉(zhuǎn)為還原型（熒光素、紅色）。該熒光信號可以用530~560nm 的激發(fā)波激發(fā)，在590nm 處可以獲發(fā)射波，檢測570 和600nm 的的吸光度值，校正監(jiān)測值，可以減去相應(yīng)的570nm 和600nm 的背景吸光度值。檢測所產(chǎn)生的熒光信號是與樣品中的活細胞數(shù)成正比的。

AlamaBlue 細胞活性檢測試劑盒的靈敏度相似于[3H]胸苷法檢測細胞增殖法。根據(jù)不同類型的細胞，AlamaBlue 可以檢測到至少40個細胞，同時保證很好的重現(xiàn)性和靈敏度。作為試鹵靈（紫紅、紅色熒光）可以進一步被還原為水解化的試鹵靈（無色、無熒光），當(dāng)細胞數(shù)量增多，所有的刃天青（7-羥基-3-羰基-10-氧化-三氫吩惡嗪）被轉(zhuǎn)換為試鹵靈（9-羥基-3-異吩惡嗪酮7-羥基-3H-吩惡嗪-3-酮），試劑盒的信號反而會發(fā)生衰減。因此，對于您所用的試劑盒來說，針對不同的細胞類型，應(yīng)該調(diào)整您的細胞數(shù)，做相應(yīng)的優(yōu)化，才能得到更好的結(jié)果。

操作說明

以下操作可用作通用指導(dǎo)建議。考慮不同細胞類型與培養(yǎng)條件的差異性，有必要根據(jù)實際情況優(yōu)化您的操作步驟。

1. 96 孔細胞培養(yǎng)板每孔100μL 培養(yǎng)基飼養(yǎng)細胞，控制細胞數(shù)目在40~10000 個/貼壁細胞，2000~500000 個/懸浮細胞。設(shè)置空培養(yǎng)基做對照。

2. 加入10μL AlamaBlue 溶液至培養(yǎng)基中，37 度孵育：24 小時（比色法讀數(shù)）；5-6 小時（熒光讀數(shù)）。

3. 檢測570nm 和600nm 的吸光度，或者用熒光微孔板讀數(shù)530nm 激發(fā)，590nm 發(fā)射波讀數(shù)。

4. 如果采用比色法檢測，選擇OD570-OD600 檢測，如果檢測熒光信號，請在校正OD 值后，先設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇合適您實驗的細胞最佳濃度。

Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒注意事項：

1、懸浮細胞用此法時必須經(jīng)離心后才能吸出上清再加DMSO。

2、Formazan 的生成不僅與活細胞數(shù)成比例，也受作用時間的影響，因此當(dāng)樣品較多時測定的OD 值可能隨時間而變。

3、MTT 溶液為黃色，需避光保存，長時間光照會導(dǎo)致失效。當(dāng)顏色變?yōu)榛揖G色時，請勿使用。MTT 溶液在4℃或較低溫度情況下會凝固，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

4、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

 a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

試劑盒使用注意說明：

1.由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。

2.最終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。

3.不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進行實驗操作，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。

4.只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到最佳的檢測結(jié)果。

5.本公司只對試劑盒本身負責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。

6.使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致ELISA實驗結(jié)果偏差。

7.若樣本為細胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細胞狀態(tài)、細胞數(shù)量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。

8.某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。