DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)真核蛋白操作步驟

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)真核蛋白操作步驟：

Ⅰ 實(shí)體組織蛋白的提取

1． 在每1mL 冷Lysis Buffer加入10 μL磷酸酶抑制劑， 1 μL蛋白酶抑制劑和 5μL 100mM PMSF，混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。

2．  每100mg固體組織置于培養(yǎng)皿中，剪碎成3mm×3mm左右的小塊，加入0.5～1 mL冷 Lysis Buffer，玻璃勻漿器上下手動(dòng)勻漿15次，注意低溫操作；

3． 取組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5mL預(yù)冷的離心管，離心10000轉(zhuǎn)/分，4℃離心5 min；

4． 取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，即為全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford法、BCA法）；

5． 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融。

Ⅱ 培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取

1． 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基后，加入10mL/150mm培養(yǎng)板的冷PBS洗兩次，每次振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng)液；

2． 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或用細(xì)胞刮子刮下的貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞及培養(yǎng)液移至離心管中， 1000轉(zhuǎn)/分離心10 min，再用10mL/150mm培養(yǎng)板的冷PBS，1000轉(zhuǎn)/分離心5 min洗兩次；

3． 在每 1mL冷 Lysis Buffer加入10μL磷酸酶抑制劑， 1μL蛋白酶抑制劑和5μL 100mM PMSF，混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。

4． 細(xì)胞洗滌后，轉(zhuǎn)至新的預(yù)冷的離心管中，加入上述配制好的冷Lysis Buffer，加入量如下表所示：

細(xì)胞數(shù)量

Lysis Buffer加入量

107個(gè)

0.5 mL～1 mL

5×106個(gè)

0.2 mL～0.5 mL

5．置于4℃搖床平臺(tái)上，溫和振蕩15 min；

6． 14,000rpm，4℃離心15min，取上清為全蛋白提取物, 蛋白定量（Bradford法、BCA法）；

7． 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融

DNA堿性膠上樣液（1.5 mL）

DNA堿性膠上樣液（10 mL)

DNA尿素-PAGE上樣液（1.5 mL）

DNA尿素-PAGE上樣液（10 mL）

DNA上樣液（紅），6×（非甘油）（見關(guān)聯(lián)產(chǎn)品）

DNA上樣液（藍(lán)），6×（非甘油）（見關(guān)聯(lián)產(chǎn)品）

DNA上樣液，6×（紅）

DNA上樣液，6×（藍(lán)）

miRNA尿素-PAGE上樣液（1.5 mL）

miRNA尿素-PAGE上樣液（10 mL）

三合一RNA上樣液（A型）

三合一RNA上樣液（B型）

核酸染料

SYBR Green Ⅱ核酸染料

超快核酸銀染試劑盒

電泳級(jí)SYBR Green I

電泳級(jí)耐熱型SYBR染料

綠如藍(lán)核酸染料（UV）（0.5 mL）

綠如藍(lán)核酸染料（UV）（1.5 mL）

綠如藍(lán)核酸染料（可見光型）

溴化乙錠干粉

溴化乙錠清除劑（EB清除劑）

溴化乙錠溶液（1.5 mL）